FerroOrange (Fe2+ indicator)

1. Préparation de la sonde :

1.1 Sortir FerroOrange du réfrigérateur et le laisser décongeler à température ambiante. Le placer dans une microcentrifugeuse à basse vitesse et centrifuger jusqu'à ce que la poudre dans le flacon se dépose au fond, puis ouvrir le couvercle.

1.2 Ajouter 35μL de DMSO au tube contenant 24μg de FerroOrange, et mélanger soigneusement en pipettant de haut en bas jusqu'à dissolution complète pour préparer une solution de stockage de FerroOrange 1mM. Si la solution de stockage ne peut pas être utilisée en une seule expérience, aliquotez-la et conservez-la dans l'obscurité à -20℃ jusqu'à un mois.

1.3 Avant l'expérience proprement dite, diluer la solution de stockage de FerroOrange 1mM à la concentration de travail souhaitée (par exemple 1uM) avec un tampon neutre ou un milieu de culture sans sérum. La solution de travail doit être fraîchement préparée et utilisée dès que possible.

Remarque : les solutions acides oxyderont FerroOrange, ce qui affectera gravement l'efficacité de la sonde.

2. Mode opératoire de la microscopie à fluorescence :

2.1. Ensemencer les cellules dans une boîte de culture fluorescente et les cultiver pendant une nuit dans un incubateur à 37℃ et 5 % de CO2.

2.2. Jeter le surnageant et laver les cellules trois fois avec du HBSS ou du milieu de culture sans sérum.

2.3. Remplacer par un milieu de culture contenant du médicament et cultiver dans un incubateur à 37℃, 5% de CO2.

Note：Optimiser le temps d'incubation en fonction des caractéristiques du médicament.

2.4. Ajouter 1 μM de solution de travail de FerroOrange et cultiver dans un incubateur à 37℃, 5% CO2 pendant 30min.

Note：Observer après l'ajout du colorant FerroOrange, sans lavage.

2.5. Observer les cellules au microscope à fluorescence.

3. Procédure opérationnelle pour la cytométrie de flux :

3.1. Ensemencer 1 x 105 cellules HeLa (dans un milieu de culture MEM contenant 10 % de sérum bovin fœtal et 1 % de pénicilline-streptomycine) dans une plaque à 6 puits et cultiver pendant une nuit dans un incubateur à 37℃, 5 % de CO2.

3.2. Laver les cellules trois fois avec du milieu de culture sans sérum (2 ml).

3.3. Ajouter du milieu de culture sans sérum (1 mL) aux cellules du groupe témoin, et ajouter du sulfate de fer ammoniacal 10 mM (10μL) (concentration finale : 100μM) aux cellules du groupe traité au sulfate de fer ammoniacal(II) dans du milieu de culture sans sérum.

3.4. Incuber les cellules dans un incubateur à 37℃ pendant 20 minutes, et laver les cellules trois fois avec du HBSS (1 mL).

3.5. Digérer les cellules avec de la trypsine (250 µl) et arrêter la réaction avec du milieu de culture contenant du sérum (1 ml), puis transférer 1,25 ml de suspension cellulaire dans un tube de microcentrifugation.

3.6. Centrifuger la suspension cellulaire à 1 500 rpm pendant 3 minutes.

3.7. Jeter le surnageant et ajouter du HBSS (1 ml) au tube de microcentrifugation, mélanger en agitant.

3.8. Centrifuger la suspension cellulaire à 1 500 tours/minute pendant 3 minutes et jeter le surnageant.

3.9. Ajouter 1μM de FerroOrange et du MEM contenant du milieu de culture sans sérum (300μL) aux cellules.

3.10. Incuber les cellules à 37℃ pendant 15 à 30 minutes.

3.11. Filtrer les cellules à travers une passoire cellulaire, et analyser l'échantillon à l'aide d'un cytomètre de flux.

4. Détection de la fluorescence :

4.1. Pour la microscopie à fluorescence : utiliser des filtres d'excitation universels G tels que ceux utilisés pour la détection Cv3.

4.2. Pour la microscopie laser et la cytométrie de flux : utiliser des lasers de 532 nm, 514 nm ou 561 nm pour l'excitation. S'il n'est pas disponible, un laser de 488 nm peut également être utilisé. La longueur d'onde d'émission est de 580 nm.

Fig. 1. Coloration FerroOrange de cellules HeLa traitées avec du sulfate de fer ammoniacal.

5. Procédure d'utilisation du lecteur de microplaques à fluorescence :

5.1. Mise en place des groupes :

Échantillon A : Cellules HeLa sans additifs.

Échantillon B : cellules HeLa avec ajout de chélateur du fer 2,2'-bipyridyl (Bpy)（GC61754）.

Échantillon C : cellules HeLa avec ajout de fer (sulfate de fer ammoniacal)（GC20135）.

5.2. Ensemencer 100 µl de suspension de cellules HeLa dans chaque puits d'une plaque noire à 96 puits (avec un fond transparent) pour obtenir une densité de 10 000 cellules/puits, et cultiver pendant une nuit dans un incubateur à 37℃, 5 % de CO2.

5.3. Laver les cellules de l'échantillon C trois fois avec 100 µl de MEM (sans FBS).

5.4. Ajouter 100 µl de sulfate de fer ammoniacal/MEM (sans FBS) (concentration finale : 100 µM) à l'échantillon C et laisser reposer pendant 30 minutes dans un incubateur à 37℃, 5% CO2.

5.5. Laver tous les puits avec 100 µl de HBSS trois fois.

5.6. Ajouter 100 µl de solution de travail de FerroOrange 1 µM aux échantillons A et C, et ajouter 100 µl de solution HBSS contenant du FerroOrange (concentration finale : 1 µM) et du Bpy (concentration finale : 100 µM) à l'échantillon B. Incuber tous les échantillons pendant 30 minutes dans un incubateur à 37℃, 5% CO2.

5.7. Mesurer l'intensité de fluorescence de chaque échantillon à l'aide d'un lecteur de microplaques multifonctionnel (Ex : 543 nm, Em : 580 nm).

Fig. 2. Résultats de la détection par lecteur de microplaques à fluorescence.

Ce protocole n'est qu'un guide et doit être modifié en fonction de vos besoins spécifiques.