PEG2000-C-DMG

Ce protocole ne fournit qu'une ligne directrice et doit être modifié en fonction de vos besoins.

Préparation des Nanoparticules Lipidiques MC3

En prenant comme exemple une thérapie à base de siRNA approuvée par la FDA ciblant l'ARNm de la transthyrétine (TTR), le rapport molaire des lipides des LNP utilisés est de 50:10:38,5:1,5 pour D-Lin-MC3-DMA (Numéro de catalogue : GC35879) : DSPC (Numéro de catalogue : GC41832) : cholestérol (Numéro de catalogue : GC17398) : PEG2000-C-DMG (Numéro de catalogue : GC63813). De plus, le rapport en poids de l'ARN à lipide est spécifié à 0,05 (poids/poids).

A. Préparation du Mélange Lipidique :

1. Dissoudre les lipides dans de l'éthanol pour créer des solutions mères à 10 mg/mL. Conserver ces solutions à -20°C pour une utilisation ultérieure.

2. Préparer le mélange lipidique en ajoutant à chaque mL : 548 µL de D-Lin-MC3-DMA (10 mg/mL), 254 µL de cholestérol (10 mg/mL), 134 µL de DSPC (10 mg/mL) et 64 µL de PEG2000-C-DMG. Mélanger soigneusement pour obtenir une solution claire. La quantité totale de lipides par mL est de 10 mg.

Remarque :

a : Le cholestérol en solution doit être maintenu à une température élevée (>37°C) pour conserver sa fluidité. Transférer rapidement la solution de cholestérol pour éviter le refroidissement ;

b : Le lipid ionisable est généralement un liquide. En raison de sa viscosité, il doit toujours être pesé plutôt que de se fier au volume de l'autopipette.

c : Le choix des lipides et les ratios peuvent être modifiés selon les besoins, ce qui affectera les propriétés des LNP (taille, polydispersité et efficacité) et la quantité d'ARNm requise.

B. Préparation du siRNA :

1. Préparer une solution de siRNA à 166,7 µg/mL en utilisant un tampon acétate de sodium à 100 mM, pH 5.

Remarque : L'efficacité de l'encapsulation est influencée par le rapport en poids lipide/siRNA. Des formulations alternatives avec des ratios variés peuvent être préparées, nécessitant des ajustements par l'utilisateur.

C. Mélange :

1. Trois méthodes couramment utilisées pour obtenir un mélange rapide des solutions sont la méthode de mélange par pipette, la méthode de mélange par vortex et la méthode de mélange microfluidique. Toutes ces méthodes de mélange peuvent être utilisées pour diverses applications.

Remarque : Le mélange par pipette et par vortex peut entraîner des LNP hétérogènes avec une encapsulation inférieure, sujettes à une variabilité. La microfluidique offre un mélange précis et reproductible pour des LNP homogènes et une haute encapsulation. Les lipides en éthanol se mélangent avec la solution aqueuse en flux individuels, formant des LNP lors du mélange, collectés dans un seul tube.

1. Méthode de Mélange par Pipette :

1.1 Pipetter 3 mL de solution de siRNA dans 1 mL de mélange lipidique (rapport 1:3). Mélanger vigoureusement pendant 20-30 secondes.

1.2 Incuber la solution résultante à température ambiante pendant jusqu'à 15 minutes.

1.3 Après le mélange, les LNP sont dialysés contre du PBS (pH 7,4) pendant 2 heures, filtrés stérilement à l'aide de filtres de 0,2 µm et stockés à 4°C.

2. Méthode de Mélange par Vortex :

2.1 Vortexer 3 mL de solution de siRNA à vitesse modérée sur le vortex. Ajouter rapidement 1 mL de la solution de mélange lipidique dans la solution en vortexage (un rapport 1:3 de mélange lipidique éthanolique à tampon aqueux est généralement utilisé). Continuer le vortexage de la dispersion résultante pendant encore 20-30 secondes.

2.2 Incuber la solution à température ambiante pendant jusqu'à 15 minutes.

2.3 Dialyser les LNP dans du PBS (pH 7,4) pendant 2 heures, filtrer à travers un filtre de 0,2 µm, stocker à 4°C.

3. Méthode de Mélange Microfluidique :

3.1 Dans un dispositif microfluidique, mélanger 3 mL de tampon siRNA avec 1 mL de mélange lipidique (rapport 1:3) à un débit total de 12 mL/min.

3.2 Après le mélange, les LNP sont dialysés contre du PBS (pH 7,4) pendant 2 heures, filtrés stérilement à l'aide de filtres de 0,2 µm et stockés à 4°C.

Remarque : Les paramètres tels que le rapport de flux et le débit total peuvent être modifiés pour affiner les LNP.

Références :

[1] Mashima R, Takada S. Lipid Nanoparticles: A Novel Gene Delivery Technique for Clinical Application. Curr Issues Mol Biol. 2022 Oct 19;44(10):5013-5027.

[2] McKenzie RE, Minnell JJ, Ganley M, Painter GF, Draper SL. mRNA Synthesis and Encapsulation in Ionizable Lipid Nanoparticles. Curr Protoc. 2023 Sep;3(9):e898.