Cell Counting Kit-8 (CCK-8)

細胞数の決定

1. 96ウェルプレートに細胞懸濁液（100 μL/ウェル）を接種する。プレートは湿潤化されたインキュベーター（例: 37°C、5% CO2）で予備培養する。
2. 各ウェルにCCK8溶液を10 μLずつ加える。気泡が入らないように注意してください。気泡が入ると吸光度の測定に干渉する。
3. インキュベーターで1 - 4時間培養する。
4. マイクロプレートリーダーで450 nmで吸光度を測定する。

細胞増殖および細胞毒性アッセイ

1. 96ウェルプレートに細胞を種蒔きする。培養試料の培地中に1,000-10,000個の細胞/ウェルの密度でシードする。37°CのCO2インキュベーターで24時間培養する。
2. プレートに検査対象のさまざまな濃度の物質を加える。
3. 適切な時間（例: 6、12、24または48時間）インキュベーターで培養する。
4. 反復ピペッターを使用して各ウェルに10 μLのCCK8溶液を加える。気泡が入らないように注意してください。気泡が入ると吸光度の測定に干渉する。
5. インキュベーターで1 - 4時間培養する。
6. プレートを読み取る前に、軽く振盪器で1分間混和して均一に分布させることが重要である。
7. マイクロプレートリーダーで450 nmで吸光度を測定する。

データ解析

統計解析を行うための方法はいくつかある。OD値または細胞数を使用することができる。以下の方法を提供する。

細胞生存率 (%) = [(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100

抑制率 (%) = [(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100

As = 実験ウェルの吸光度（細胞、培地、CCK8、試験化合物の吸光度）。

Ab = 空白ウェルの吸光度（培地とCCK8の吸光度）。

Ac = コントロールウェルの吸光度（細胞、培地、CCK8の吸光度）。

標準曲線の作成

1. 細胞懸濁液で細胞の数を数える。
2. 培地を使用して、細胞懸濁液を濃度勾配に希釈する。通常、各グループに複数の重複ウェルが必要である。ウェルに接種する前に、細胞を再び注意深く混和してください。各ウェルにおける細胞懸濁液の体積は同じである必要がある。
3. 細胞が付着するまでインキュベートする（通常2-4時間）、その後、100 μLの培地あたり10 μLのCCK8を加える。1-4時間の間インキュベートし、マイクロプレートリーダーで450 nmで吸光度を測定する。細胞数をX軸座標、吸光度をY軸座標として標準曲線を作成する。
4. 標準曲線を使用して、テスト対象のサンプルの細胞数を決定できる。この標準曲線を使用するための前提条件は、培養条件が同じであることである。

注意事項

1. 薬物とCCK8が培地内で均一に分布していることを確認してください。
2. 細胞が増殖するほど色が濃くなる。細胞毒性が強いほど、色が薄くなる。
3. 接着性細胞の場合、少なくとも1,000個の細胞/ウェル（100 μL培地）が必要である。白血球の場合、少なくとも2,500個の細胞/ウェル（100 μL培地）が必要である。推奨される96ウェルプレートはウェルあたり最大25,000個の細胞を含むことができる。24ウェルまたは6ウェルプレートを使用してテストを実施する場合は、対応するウェルあたりの細胞数を計算し、各ウェルの総液体容量の10%に相当するCCK8の体積を調整してください。
4. CCK8アッセイは生細胞の脱水素酵素活性に基づいている。脱水素酵素活性に影響を与える条件や化学物質があると、実際の生存細胞数とCCK8で測定される生存細胞数との間に違いが生じる場合がある。
5. WST-8は還元剤と反応してWST-8フォルマザンを形成する。還元剤（抗酸化剤など）が存在する場合、テストに干渉する。システムにより多くの還元剤が存在する場合は、それを除去する必要がある。
6. インキュベーション後の背景OD値は通常0.1-0.2単位である。
7. 気泡がウェルに入らないように注意してください。気泡が入ると吸光度の測定に干渉する。
8. CCK8溶液を滅菌する場合は、0.2 μmメンブレンフィルターを使用してください。
9. インキュベーション時間は、ウェル内の細胞の種類と量に応じて異なる。一般的に、白血球は色が薄く、より長いインキュベーション時間（最大4時間）または多数の細胞（約10^5細胞/ウェル）が必要である。
10. 細胞懸濁液に高い濁度がある場合、600 nm以上でサンプルのOD値を測定し、引き算してください。
11. CCK8は細胞染色には使用できない。
12. 培地中のフェノール赤は実験結果に影響しない。フェノール赤の吸光度は、計算中にブランクウェルの背景の吸光度を引くことで除去できるため、検出に影響しない。
13. CCK8の毒性は非常に低いである。CCK8アッセイが完了した後、同じ細胞をクリスタルバイオレットアッセイ、ニュートラルレッドアッセイ、またはDNA蛍光アッセイなど、他の細胞増殖アッセイに使用できる。（細胞が極めて希少でない限り、推奨しない。）
14. このキットは大腸菌では使用できるが、酵母細胞では使用できない。
15. プレートを読み取る前に、シェイカーで軽く混ぜることを推奨する。
16. 細胞をプレートの中心付近のウェルに接種することを推奨する。外側の円のウェルの培地は蒸発しやすいため、PBS、水、または培地で埋めてください。
17. 450 nmフィルターがない場合、430から490 nmの吸光度を使用することもできる。最適な感度のためには450 nmフィルターを使用してください。
18. 450 nmで吸光度を測定してください。二重波長測定を行う必要がある場合、650 nmの吸光度を基準波長として決定する。
19. 薬物中の金属イオンの存在はCCK8の感度に影響を与える可能性がある。1 mMの最終濃度で鉛塩化物、鉄塩化物、および硫酸銅はそれぞれ色反応の5%、15%、および90%を阻害し、感度を低下させる。最終濃度が10 mMの場合、100%抑制されてしまう。