TRITC Phalloidin

이 계획은 단지 가이드를 제공하며 구체적인 필요에 따라 수정하시기 바랍니다.

1.염색 용액 준비

(1) 염료 저장 용액: 저온 보관된 염료 저장 용액을 꺼내 실온에서 최소 20분간 둡니다. 낮은 속도로 원심 분리하여 겔관 바닥에 제품을 집중시킵니다. 단일 용량으로 저장 용액을 분사하고 -20°C의 어두운 곳에 보관하면 일년간 안정적으로 보관됩니다;

(또는) 저온 보관된 설상 분말을 취하여 실온에서 최소 20분간 둡니다. 낮은 속도에서 천지한 후 메탄올이나 무수 DMSO를 추가하여 완전히 녹여 10-100 μM의 저장 용액을 준비합니다. 준비된 저장 용액은 분사하여 -20°C나 -80°C의 어두운 곳에 보관하시기 바랍니다;

(2) 염료 작업 용액: 용액 형태로 제공되는 제품은 1000xDMSO 저장 용액의 형태로 제공됩니다. PBS(이 용액에서 사용된 PBS는 pH 7.4의 1xPBS)를 사용하여 저장 용액을 1:1000의 비율로 희석하여 1x 염색 작업 용액을 희석합니다. 이식충으로 샘플을 취하고 펜싱하여 혼합합니다; 만약 자체 제작한 염료 저장 용액이면 PBS를 사용하여 10-200nM의 작업 용액으로 희석합니다.

알림:

① 실제 상황에 따라 작업 유체의 농도를 조정하고 최적화하여 지금 준비해 주십시오.

② 1% BSA를 포함한 PBS 희석 저장 용액을 사용하여 비특이성 배경 염색을 줄이고 핼로이드린이 관벽에 붙는 가능성을 최소화할 수 있습니다.

2.세포 염색

(1) 세포를 슬라이드에 재배양하여 70-80%의 접합도에 이르게 합니다.

(2) 배양액을 흡인하고 37℃로 예열된 PBS로 세포를 두 번 세척합니다.

(3) PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고 실온에서 10분 동안 고정시킵니다.

알림:

① 메탄올은 고정 과정에서 액틴을 파괴할 수 있습니다. 메탄올이 없는 고정제를 사용하는 것이 좋습니다;

② 세포는 또한 실온에서 3-4% 포르말린을 포함한 PBS에서 10-30분 동안 고정될 수 있습니다.

(4) 실온의 PBS로 세포를 30초마다 2-3번 세척합니다.

옵션 단계 ①: 10 mM 에탄올아민(또는 0.1 M 글리세인)을 포함한 PBS로 세포를 5분 동안 처리하여 과도한 포멀데하이드를 중화시킵니다;

옵션 단계 ②: 고정된 세포에 0.1% 트리톤 X-100을 포함한 PBS를 추가하고 3-5분 동안 두서활성화를 높이기 위해 기다린 후 PBS로 세포를 다시 2-3번 세척합니다.

(5) 방음의 어두운 곳에서 30분 동안 슬라이드에 있는 세포를 완전히 덮는 약 100 μl의 신선하게 준비된 염색 작업 용액을 취하고 실온에서 30분 동안 배양합니다.

주의:

① 보통 4℃-37℃가 염색에 적당합니다. 작업 용액의 증발을 방지하기 위해 배양 과정 중 커버슬립을 밀폐된 용기에 놓으세요;

② 필요한 경우 TRITC와 다른 형광 스펙트럼을 가진 핵 염색 용액을 이 시점에 추가할 수 있습니다.

(6) 실온에서 PBS로 세포를 매번 30초2-3번 세척해 주세요.

(7) 필터 종이로 세포 표면의 액체를 최대한 흡수한 후 커버슬립을 반전하여 형광방지개질제 한 방울이 있는 유리 슬라이드에 올려놓고 종이 타올로 과도한 끈기제를 제거한 후 투명한 네일 폴리시로 커버슬립 주변을 밀봉하세요. 이 방법으로 처리된 슬라이드는 어둠에서 4℃로 최소 6개월 보관하면 F-actin 염색이 유지될 수 있습니다.

(8) 형광 현미경으로 염색 결과를 관찰하세요. TRITC의 최대 발진/방출 광선은 546/575nm입니다.

주의사항:

① 세포는 세포 배양판/교반기 접시에서 염색할 수 있습니다. 단계 (7) 은 웰에 형광 방지제 수액를 한 방울씩 추가하여 형광을 보호하는 데 변경됩니다;

② Phalloidin 염색은 메탄올이나 아세톤으로 고정된 세포에 적합하지 않습니다. 이러한 고정제는 액틴 구조를 파괴하고 폴로이드인 염색을 방해합니다. 0.2% 글루타르알데히드로 세포를 고정하는 것이 권장됩니다;

③ Phalloidin은 pH에 민감합니다: pH 값이 증가하면 Phalloidin의 주요 썸에더 브리지지가 절단되어 액틴에 대한 친화력이 상실됩니다;

④ Phalloidin 염색은 항체 염색과 함께 사용할 수 있습니다. 1차 또는 2차 항체와의 배양 중에 Phalloidin 결합체를 추가하는 것이 권장됩니다;

⑤ Phalloidin 결합체의 최적 농도와 큐레이팅 시간은 특정 세포 유형, 고정/샘플 준비 조건 및/또는 세포/조직의 프로브 투과성에 따라 다릅니다;

⑥ 현탁 세포는 poly-D-lysine 마이크로 플레이트나 커버슬립에 부착시킬 수 있으며, 그 후에 착착 세포 프로토콜에 따라 염색할 수 있습니다;

⑦ 세포 상태가 좋지 않은 경우 염색 용액과 세척 용액에 혈청 (2-10%)을 추가하는 것이 권장됩니다;

⑧ 일부 경우에 빠른 Phalloidin 염색을 위해 일겹법을 사용할 수 있습니다: 3.7% 포멀린과 50-100µg/mL의 팜마이토이 라이소스포스피하티딜콜린이 Phalloidin과 4℃에서 결합됩니다. 결합물에 20분 동안 배양한 후, 세 번 세척하고 장착합니다;

⑨ 고정되지 않은 샘플에서 염색할 때 Phalloidin 결합은 액틴 서브유닛이 액틴 섬유 끝에서의 해체율을 줄여 액틴 섬유의 해체를 방지하여 액틴 섬유를 안정화합니다;

⑩ 다른 샘플 유형의 염색 과정에서 고정 조건을 최적화하고 염색을 용이하게 하기 위해 일정 범위 내에서 고정 시간과 포름 알데히드 농도를 변경하는 것이 권장됩니다;

⑪ Phalloidin formalin 고정 및 투과화된 조직 슬라이드, 세포 배양 및 기타 샘플 유형, 그리고 세포 없는 실험에도 사용할 수 있습니다. 또한 밀랍 포함 샘플에서 사용할 수 있으며 Phalloidin 염색은 불가능합니다. 항원 복구가 필요합니다;

⑫ Phalloidin의 LD50은 2 mg/kg입니다. 사용 시 보호에 주의해주세요. 그러나 보통 Phalloidin은 매우 작은 양으로 사용되므로 중대한 안전 위험은 없습니다;

⑬ 모든 형광 염료는 끈기 현상이 있습니다. 형광억제를 늦추기 위해 빛을 피해하사기 바랍니다;

⑭ 안전과 건강을 위해 실험복과 일회용 장갑을 착용해 주시기 바랍니다.